Cell counting 계산 - Cell counting gyesan

Q. cell counting하는 계산좀 알려주세요ㅠ

ㅠㅠ  |  2011.03.02 11:28

 제가 T75 flask 에서 cell을 띠어서 centrifuse후, media를 10ml 첨가한 다음 suspend 후,
 tryphan 20ul + cell 20ul 섞어서 10ul를 취해서 센 결과
 총 86개가 나왔구요. 이 cell을 6 well plate 3개에 well당 총 2ml씩 넣으려고 합니다.
 well당 원하는 농도는 1.5 X 10^5 cell/well 이구요.

 counting 계산부터 plate에 들어갈때 cell과 media의 양이 어떻게 들어가는지,
 전 과정을 자세하게 알고싶습니다.
 아직 실험을 몇번 안해봐서..자세하게 알려주셨음 합니다.

counting chamber를 어떤 걸 쓰시는 지에 따라서 계산법이 달라질 수 있습니다만,
일반적으로 많이 쓰는 규격에 준해서 말씀드릴게요~

대개 chamber의 네 귀퉁이에서 셀을 카운트하고 그 평균값을 가지고 계산을 하는데,
님께서 말씀하신 86개가 네귀퉁이의 평균값이라고 쳤을 때,
(혹 네귀퉁이의 합이 86개라면 4로 나누어서 다음 계산에 사용해 주셔야겠죠?)
그리고 트리판블루와 셀이 동량으로 들어갔으니 희석배율인 2를 곱해줍니다.
그리고 님께서 넣으실 때 마이크로리터 단위를 사용하셨으므로
밀리리터 단위로 환산하기 위해 1000을 곱해주어야 하구요, 그리고 챔버의 높이가
일반적으로 사용하는 챔버 기준으로 0.1mm라고 쳤을 때 1ul는 1mm^3이므로
다시 10을 곱해 주어야 합니다.
그렇게하면 86*2*10^4/10ml(님께서 10ml로 서스펜션하셨다고 했으니까..)
란 결과가 나옵니다. 결국 172*10^3=1.72*10^5/ml 이 되겠군요.
님께서 well당 1.5*10^5개의 셀을 원하신다니 1ml:1.72*10^5=Xml:1.5*10^5 이런 식으로
비례식을 세워서 서스펜션 중 Xml을 넣으시고 배지는 (2-X)ml을 첨가해주시면 되겠네요~

윗분 말씀이 조금 이상해서 추가 답변 드립니다.
일반적인 hema의 경우 네개의 사각형을 counting합니다.
님께서 counting한 수가 86이라면 이것을 4로 나누어 주는 것은 맞습니다.
그리고 10^4이 왜 붙는지는 위에 분이 잘 설명하셨구요. 그리고 나머지는 님께서
사용하신 희석 배수를 넣어주면 됩니다.
1. 트리판 블루랑 cell (1:1)이었으니까 이것은 2배 희석입니다.
2. cell counting은 1ml에 해당하는 세포수를 결정하는 것인데 님은 10ml에 준비하셨으니까
  이것이 10배 희석입니다.

간단히 하면
86/4 * 2 * 10 * 10^4
이렇게 됩니다. 그럼 4.3 X 10^6 이 나옵니다.
이 cell을 위에 분처럼 비례식으로 6 well에 깔아 주셔도 되구요

아니면 4.3 X 10^6 / 10ml 의 cell에 33 ml을 추가해서
4.3 X 10^6 / 43ml 이 되게 해주시면 계산하기 쉽습니다.
이러면 1ml을 따면 1X10^5이 되므로 1.5 ml을 따면 1.5X10^5이 됩니다.
그리고 나머지 0.5ml씩 추가해서 넣어주시면 2ml이 되지요...

이 방법은 다른 실험에도 많이 응용될수 있으니 잘 알아두시면 좋습니다.
5.4 X 10^7/ 1ml 이 있을 경우에 만약 1X10^6을 덜고 싶다면
이것도 5.4X10^7을 5.4 ml에 넣어 버리면 1ml을 덜면 1X10^7이 되고
100ul를 덜면 1X10^6이 되어 다른 실험에도 쉽게 응용할 수 있습니다.
그럼... 이상 윗분의 추가답변이었습니다.

<본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, BRIC에서 추가적인 검증과정을 거친 정보가 아님을 밝혀드립니다.>

세포실험 프로토콜 5강. 셀 카운팅과 웰 분주

추천글 : 【생물학】 세포배양 목차 

가. 셀 카운팅

나. 웰 분주

가. 셀 카운팅(cell counting)

먼저 웰 플레이트(Well Plate)에 분주할 때 세포의 수를 일정하게 처리해 줄 필요가 있다. 따라서 웰 분주(Well Seeding)를 하기 전 세포수 계산을 해야 한다. 최근에는 셀 카운팅 작업이 다양한 cell counter에 의해 자동화되었다. (예 : EVE automated cell counter from nanoentek. inc) 

1. 배양 용기에 있는 상층액을 제거한다.

2. DPBS로 1 ~ 2회 세척한 뒤 제거한다.

⑴ DPBS는 생리식염수와 유사한 것으로 노폐물 제거 및 혈청 희석의 역할을 한다.

⑵ 150π 배양 접시의 경우 10 ㎖ 이상을 넣는다.

⑶ 90π 배양 접시의 경우 7 ㎖ 이상을 넣는다.

3. 트립신(Trypsin)-EDTA가 배양 용기 표면을 간신히 잠기게 할 정도만 첨가한다. (효소는 양이 중요한 게 아님)

⑴ 트립신은 단백질분해효소로서 세포의 ECM을 잘라준다.

⑵ 150π 배양 접시의 경우 4 ㎖를 넣는다.

⑶ 90π 배양 접시의 경우 3 ㎖를 넣는다.

⑷ T-25 플라스크의 경우 2 ㎖를 넣는다.

4. 배양 용기를 4분 간 인큐베이터에 보관한다.

5. 세포가 탈착된 것을 현미경으로 확인한다.

6. 배양 용기에 있는 세포 현탁액을 코니컬 튜브에 옮겨 담는다.

⑴ 세포가 간신히 붙어 있는 경우가 잦기 때문에 세포 현탁액을 용기 바닥면에 골고루 뿌려주어야 한다.

7. 현탁액을 원심분리하여 침전시킨다.

8. 침전된 세포에서 상층액을 제거하고 새로운 배양액을 첨가하여 세포 현탁액 10 ㎖를 만든다.

9. 세포현탁액 10 ㎕를 마이크로 피펫(Micro-pipette)을 통해 건져낸 뒤 EP 튜브에 넣는다.

10. 0.4 % 트리판 블루(Trypan Blue) 용액 10 ㎕를 해당 EP 튜브에 넣고 10분 동안 회전(Vortex)시킨다.

⑴ 살아있는 세포는 트리판 블루를 흡수하지 못하므로 하얗게 보임

⑵ 죽어있는 세포만 트리판 블루로 염색되므로 살아있는 세포와 죽은 세포를 구분할 수 있음

11. 튜브 안에 있는 10 ㎕ 용액을 헤마사이토미터(혈구계수기, Hemocytometer)에 넣는다.

12. 헤마사이토미터를 광학현미경으로 관찰한다. 대물렌즈의 배율은 ×10으로 한다.

13. 광학현미경 관찰 방법

Figure. 1. 헤마사이토미터를 관찰한 모습1

Figure. 2. 헤마사이토미터 계산을 위한 구역 설정

⑴ 헤마사이토미터의 치수는 1 ㎜ × 1 ㎜ × 0.1 ㎜ (높이)이다.

⑵ 세포 개수는 R 구역을 통해 계산하거나 W 구역(a1, a2, a3, a4)을 계산하는 방법이 있다.

⑶ W 구역의 공식

① 경계선에 걸친 것은 ㄱ 자 혹은 ㄴ 자에 해당하는 모서리 부분만 세는 것으로 사전에 결정한다.

② 희석계수(dilution coefficient) : 용액(sol)에 대한 트리판 블루 + 용액(sol·trp)의 부피비, 즉 2이다.

⑷ 예제

① 세포 현탁액에는 1 ml의 medium이 있음 

② 세포 현탁액 20 ㎕를 덜어 trypan blue 20 ㎕와 섞음 

③ 그 중 10 ㎕를 덜어 헤마사이토미터로 관찰한 결과 4칸에서 216개 관찰

④ 계산 

14. 셀 카운팅 유의사항

⑴ 세포들이 single cell로 분리되도록 할 것

⑵ 적절한 dilution을 할 것 : 100 ~ 300 cells / 5 squares가 적절함

⑶ 헤마사이토미터에 적정량만큼 채울 것

나. 웰 분주(well seeding)

세포수 계산이 선행되어야 한다.

Figure. 3. 웰 분주

1. 코니컬 튜브에 세포현탁액을 넣고 리서스펜션을 하여 세포의 밀도를 균일하게 만든다. 

2. 미리 웰에 증식용 배지를 넣어둔다.

⑴ 6 웰 플레이트의 경우 2 ㎖를 넣는다.

⑵ 96 웰 플레이트의 경우 200 ㎕를 넣는다.

3. 적당한 수의 세포가 들어가도록 잘 분배하여 웰에 세포 현탁액을 넣는다.

⑴ 6 웰 플레이트의 경우 50,000 cells가 들어가도록 한다.

⑵ 96 웰 플레이트의 경우 1,000 ~ 3,000 cells가 들어가도록 한다.

4. 별도의 컨트롤(Control; Blank)을 두어 세포만 없이 배지만 있는 빈 웰을 만든다.

입력: 2013.12.29 02:46